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普通遗传学-第19部分
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右院芨叩钠德首疲┨迦旧宓拇菰蚣伲ㄖ挥�10…6~10…7),由F因子带动的染色体基因转移只是个别和少数基因片段。如有连续的基因转移,可能是F+群体中偶然存在Hfr变异所致。
图5…21 F+×F…和Hfr×F…中F因子转移示意图
(a)在F+×F…交配中,F因子从供体转移到受体细胞 (b)在Hfr×F…交配中,转移到
受体细胞中的F因子和细菌基因通过整合产生Hfr菌株
Hfr×F…杂交 Hfr是F因子插入到染色体上形成的菌株,F因子插入到染色体上的频率约为每代10…5~10…7。F因子的插入并不是随机的,在染色体上有许多特定的插入位点,它们与F因子上的插入序列有极大的同源性。Hfr×F…细菌杂交与F+×F…有相同的F因子转移过程。当Hfr的细菌染色体进入F…后,在一个短时间内,对细胞中某些位点来说,是一段二倍体的DNA。这样的细菌称为部分二倍体(partial diploid)或部分合子(merozygote),其中来自供体的DNA称外基因子(exogenote),受体染色体则称为内基因子(endogenote)图(5…22a)。部分二倍体发生单数交换,会使环状染色体打开,产生一个线性染色体,使细胞不能成活。发生偶数次交换,才能产生遗传的重组体,外源基因才能整合到寄主的染色体并中使细菌染色体保持环状结构(图5…22c)。
图5…22 部分二倍体形成及单交换和双交换的后果
(a)部分二倍体形成 (b)单数次交换产生线状染色体 (c)双交换产生有活性
的重组子和片段。片段在以后的细胞分裂中丢失,所以不会出现相反的重组子
结合过程通常在DNA转移尚未完成时就己自行中断,但有时Hfr在结合桥断裂之前可将其整个染色体转移到受体细胞中,使受体细胞转变成Hfr。
5。4。1。3 中断杂交实验绘图
1957年E。Wollman和E。Jacob设计了著名的中断杂交试验(interrupted mating experi…ment)。试验中供试的Hfr菌株对链霉素敏感(strs),对叠氮化物有抗性(azir),对T1噬菌体有抗性(tomAr),对半乳糖(garl+)和乳糖(lac+)都是原养型。
Hfr菌株的基因型是strs azir tonAr tonAr gal+ lac+ 。
F…菌株的基因型是strr azis tonAs gal… lac… 。
他们将大约10倍的F…菌株与Hfr对数生长期细菌混合培养,每隔一定时间间隔取样,在食品搅拌器中剧烈振荡以中断杂交,分开已经紧密接合的供体…受体杂交对。然后将振荡后的培养物接种到含有链霉素的完全培养基上,杀死所有的Hfr细菌,以便选择结合后体即含有供体基因的抗链霉素的受体细菌。然后对形成菌落的F…细胞用影印法测试其基因型,结果见图5…23。从图中可以看到在接合作用开始后的9min,最早出现的重组体有10%含Hfr菌的azir基因,但几乎还没有tonAr、lac+、gal+基因。25min时,gal+基因才出现。随着时间推移,从Hfr得到的某个等位基因重组体的百分率增加。如在11min时,tonAr首先在重组体中出现,15min后达到40%,25min后达到80%。其他即使增加时间,其重组百分数也不会改变。
图5…23 中断杂交后,重组体中Hfr遗传性状出现的频率
各标记基因进入F…细胞中的时间不同,达到最高水平的时间也不同
标记基因在受体细胞中出现频率完全取决于重组频率,而且Hfr菌株的基因是按一定的线性顺序依次进入F细胞。由于每单位长度的染色体迁移之速度是保持不变的,因此,每个基因进入F…受体细胞的时间就给它们提供了遗传图距的尺度。离转移原点(orgin;O)越近,进入F…细胞越早,反之则晚。Wollman和Jacob曾把图5…23的实验结果绘制成直线连锁图:
O
F因子能够整合到染色体的许多位置,表5…3就是用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序。尽管每个菌株的基因转移顺序有所不同,但转移的顺序并不是随机的。例如,his基因都有gal在一边,gly在另一边。这种基因转移的差异就是由于各个Hfr菌株间F因子在染色体上的整合位点和整合方向不同,能形成不同原点和转移方向的缘故。
表5…3 用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序
Hfr 基因转移顺序
HfrH 0 Thr Pro lac pur gal his gly thi
1 0 Thr Thi gly his gal Pur lac pro
2 0 Pro Thr thi gly his gal pur lac
3 0 Pro Lac Pro thr thi gly his gal
AB312 0 Thi Thr pro lac pur gal His gly
如果我们将表5…3中的各种Hfr菌株的基因顺序当作一个环状结构来考虑,则这5种中断杂交结果都是相同的。例如在HfrH中,首先转移的基因是thr;最后转移的是thi;而在Hfr1中这2个基因则是一个接一个转移的(首先是thr;然后是thi)。所以只有这2种Hfr菌株都是环状染色体,二者的基因顺序才会相同,只是转移起点○(DNA复制起点)不同。再看AB312,这2个基因转移的顺序是thi转移在先,然后是thr;同其他菌株的差别只是转移方向和转移起点不同。根据表5…3资料,绘制5个大肠杆菌环状染色体图如图5…24。J。Cairns(1960)利用电子显微镜观察到大肠杆菌的DNA确实是环状DNA分子,后来大家自然就接受了大肠杆菌的环状染色体图。
图5…24 大肠杆菌5个Hfr菌株的环状染色体图
在大肠杆菌以及其他的细菌中,除了存在F因子外,还存在其他一些感染因子。同F因子一样,当它们在细胞质中以自主状态存在时,便被称为质粒。有些质粒不能整合到染色体上,还有一些质粒同F因子的行为相似,可以整合到染色体上,如温和性噬菌体等。这类既可以整合到细菌染色体上,又可自主存在于细胞质中的质粒称为附加体。
5。4。1。4 大肠杆菌的环状染色体图
在中断杂交实验中,主要是根据基因转移的先后次序,以时间分钟(min)为单位,求出基因间的距离。如果2对基因间的时间单位接近2min,用中断杂交实验测定基因间的正确图距就不很可靠,最好用传统的重组作图法。例如,在Hfr lac+ ade+×F…lac…(乳糖不发酵)ade…(腺嘌呤缺陷型)的中断杂交实验中,己知lac…ade2个基因是连锁的,且ade是最后进入F…受体的,那么,完全培养基中不添加腺嘌呤,长出的菌落则为接合后体F…ade+。因为ade+是最后进入细胞的,转移顺序在前面的lac+自然也己进入。所以在我们选出的F…adc+中,一定是由同时得到lac+和ade+的部分杂合体。如果我们得到F…ade+的同时是lac+,表明lac…ade之间没有发生过交换;如果是lac…,表明在这2个基因之间发生过交换(图5…25)。所以求lac…ade两基因间的距离或重组频率可用下式表示:
重组值=
中断杂交实验己证明lac…ade这两个基因间的距离是1min。用重组作图法,算出的重组值是20%。因此,时间单位和重组值的关系大致为1个时间单位(1min)相当于20%的重组值。所以,两基因间的距离以时间为单位在接近2min时,测得的基因间距离就不那么可靠。
图5…25 外基因子与内基因子的重组
(a)重组子同时含有供体标记基因lac+,基因型是lac+ade+
(b)重组子只含有ade+,基因型是lac…ade+
根据中断杂交和基因重组作图法以及其他基因定位实验的结果,己绘制出大肠杆菌环状的遗传学图(图5…26)。
图5…26 大肠杆菌环状染色体图
示大肠杆菌环状染色体图上部分基因
5。4。2 转化
5。4。2。1 转化的发现
转化(transformation)最初是指细菌细胞从周围介质中吸收来自另一不同基因型细胞的DNA而使它的基因型和表型发生变化的现象,是细菌中最早发现的遗传物质转移形式。1928年,英国学者F。Griffith在利用肺炎双球菌(Diplococcus pmeanomiae)感染家鼠的试验中,把不产荚膜的无毒的粗糙型肺炎双球菌和加热杀死后的产荚膜的有毒光滑型肺炎双球菌混合注射小鼠,意外发现小鼠被感染致死,而且还从小鼠的血液中分离出活的产荚膜的肺炎双球菌,从而发现了转化现象。1944年美国化学家Avery等从元素分析、酶学分析、血清学分析以及生物活物鉴定等方面证实了无细胞提物中引起肺炎双球菌荚膜转化的转化因子是DNA。研究表明,这是由于死亡后的细菌裂解,其DNA遗留在培养基上,被其他细胞所摄取并使之发生转化。这一试验第一次为遗传物质是DNA而不是蛋白质提供了直接的证据。到目前为止,已经在多种细菌中报道了转化现象。转化的研究不但在理论上有重要意义,而且在基因工程中是将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种重要手段。用除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程则称为转染(transfection),这是转化的一种特殊形式。
5。4。2。2 转化过程
转化因子的吸附 外源DNA首先必须吸附在细菌胞表面的一些接受位点上,然后才能进入受体细胞内,受体细胞的生理状态与转化效率有关。细菌能够吸收外源DNA时的生理状态称为感受态(petence)。感受态和非感受态的细胞都能吸附DNA,但是只有前者所吸附的DNA才不能被洗去,是稳定的。许多细菌的感受态都在对数生长期的后期迅速出现。有人认为感受态是处于DNA合成刚刚停止,蛋白质合成继续活跃的时期。一定浓度的钙离子能够提高细菌的转化效率。细菌细胞能吸附的DNA主要是双链状态的。转化效率还取决于感觉态细胞的浓度和供体DNA浓度。供体DNA结合到受体细胞表面开始是可逆的,这主要与细菌细胞表面的吸附位点有关。据估计一个细菌细胞表面大约有50个吸附位点。吸附位点饱和后,就阻止其他双链DNA的结合,而处于不可逆状态。此时供体DNA不再受培养基中DNA酶的破坏。肺炎双球菌和枯草杆菌对于DNA的吸附没有专一性,甚至对鱼的DNA也能吸附。
吸收 细菌细胞表面的2种DNA酶在转化中起重要作用。细菌细胞壁上的一种核酸核酶内切吸附着的DNA切成大约14kb的片段。然后细胞膜上另一种核酸酶把一条单链切除,使另一条单链进入细胞。
整合 供体的单链DNA片段一旦进入细菌细胞,转化因子的单链DNA和受体染色体的某一部分联会,并进一步置换受体的对应染色体区段,稳定地整合到受体DNA中(图5…27)。DNA的同源性是转化效率高低的一个重要因素,一般亲缘关系越远,转化的可能性越小。
5。4。2。3 转化在遗传分析中的应用
转化因子是平均大小为20000bp的DNA片段,可能带有若干个原因。如果供体的两个基因紧密连锁在一条DNA片段上,它们同时转化的效率就很高即所谓双转化(double transformation)。
图5…27 细菌的转化
单交换使细胞染色体形成线状分子,细胞不能成活,只有双交换才能产生能成活的转化体
2个不连锁基因的2个DNA片段也可以为同一个细菌所吸收。在转化DNA浓度较低时,紧密连锁基因的双转化效率要比不连锁的或相隔一定距离的基因双转化效率高得多。假定A和B基因是连锁的,当DNA浓度下降时,AB转化频率的下降和A或B的转化频率的下降相同。假如A和B并不连锁,即AB转化频率的下降将远远超过A或B的转化频率的下降(图5…28)。
图5…28 连锁的和不连锁的两个基因同时转化的效率
(a)A或B的转化 (b)AB同时转化,A和B在同一DNA片段上 (c)A和B不在同一DNA片段上
枯草杆菌中不存在像大肠杆菌的细胞接合系统,其遗传学分析主要依靠转化和转导。转化作图的原理与结合的重组作图相似,这里用trp和tyr标记的连锁测定对转化作图加以说明。trp…和try…缺陷型菌株是不能在没有色氨酸和酪氨酸的基本培养基上生长的,用2条具一个原养型基因DNA分子(trp+2yr…1和trp…2 tyr+1)和一条双原养型基因的DNA分子(trp+2tyr+1)分别转化trp…tyr… 双突变菌株。结果见表5…4。2个转化DNA分子产生的结果中,双转化类型极少,这是由于2个分离的转化DNA片段同时与受体重组是很困难的。而在trp+tyr+供体的转化中,双转化子的效率就明显增加,因为这2个基因是连锁的。2个基因标记相距越远,就越容易获得单转化;2个基因位置越近,获得双转化的可能性就越大。trp2和tyr1基因间的重组率应是196+328/(196+328+367)×100%=58。8%。这个数值称为q值�
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